Elektroforesis dengan Agarose Gel dan SDS-PAGE

-

Terdapat dua metode untuk membedakan protein hewani dan protein campuran hewani nabati, yaitu: High Performance Liquid Chromatography dan Electrophoresis. 

High Performance Liquid Chromatography

Penelitian Bargen et al. (2014) menggunakan metode HPLC-ESI-MS/MS (High Performance Liquid Chromatography - Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry) untuk mendeteksi daging kuda dan babi dalam makanan olahan.

Electrophoresis

            Elektroforesis merupakan pemisahan protein berdasarkan muatan dengan menggunakan medan elektrik pada media seperti Agarose dan Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide gel electrophoresis. 

a.      Agarose Gel Electrophoresis

Agarose Gel Electrophoresis merupakan salah satu cara yang paling efektif dalam pemisahan fragmen DNA dengan variasi ukuran yang beragam, mulai dari 100bp hingga 25 kb. Agarose adalah hasil isolasi dari rumput laut Gelidium dan Gracilaria, serta terdiri dari subunit agarobiose (L- dan D- galaktosa). Selama gelasi, polimer agarose berasosiasi secara non-kovalen dan akan membentuk jaringan ikat yang berpori dan dapat menentukan molekul gel dengan bertindak sebagai penyaring.

Pemisahan DNA menggunakan Agarose Gel Electrophoresis adalah dengan memasukkan DNA ke dalam sumur pre-cast, kemudian arus listrik dialirkan. DNA dan RNA mempunyai tulang fosfat yang mempunyai muatan negatif, oleh karena itu ketika arus listrik dialirkan fragmen DNA akan bermigrasi ke anoda yang bermuatan positif. DNA memiliki rasio massa/ muatan yang seragam, molekul akan dipisahkan berdasarkan ukuran dalam agarose gel sehingga masing-masing dari molekul akan mempunyai jarak tempuh yang berbeda-beda, di mana jarak yang ditempuh berbanding terbalik dengan log dari berat molekulnya. Agarose gel electrophoresis akan melakukan pemisahan berdasarkan ukuran dan muatan, molekul yang mempunyai ukuran yang lebih kecil maka akan menempuh jarak yang lebih jauh karena pada molekul yang berukuran besar akan mengalami pengkusutan sehingga membutuhkan waktu yang lebih lama. Kemampuan dari migrasi DNA dan molekul tergantung dari beberapa faktor, seperti ukuran molekul, konsentrasi agarose, konformasi dari DNA, tegangan arus yang diberikan, adanya etdhidium bromide, dan penyangga elektroforesis.

Ukuran dari molekul akan mempengaruhi perpindahan jarak, karena ukuran molekul yang lebih kecil akan dapat cepat menempuh jarak yang lebih jauh bila dibandingkan dengan molekul berukuran besar. Konsentrasi agarose yang tepat dapat dibutuhkan tergantung dari ukuran fragmen DNA yang akan dianalisis.  Konformasi dari DNA, di mana DNA yang memiliki berbagai konformasi yang belum terpotong enzim restriksi akan bermigrasi dengan kecpatan yang berbeda, DNA linier dan super coiled akan bergerak lebih cepat bila dibandingkan dengan nicked DNA dan open circular. Tegangan arus berbanding lurus dengan tingkat migrasi fragmen DNA linier, semakin besar voltase yang diberikan maka kecepatan DNA bermigrasi juga meningkat, namun besar voltase tetap harus dibatasi karena voltase yang terlalu tinggi akan bersifat panas dan dapat melelehkan gel. Ethidium bromide merupakan intercalating agrnts yang dapat menyisipkan asam nukleat dan memungkinakan terdeteksinya fragmen DNA pada gel. Ethidium bromide sendiri dapat digabungkan dengan agarose gel atau pada sampel yang sebelum dimuat agar memudahkan visualisasi fragmen, adanya pengikatan ethidium bromide ke DNA akan mengubah massa, kekakuan, dan mobilitasnya. Penyangga elektroforesis terdapat banyak jenis, namun yang biasanya yang digunakan adalah Tris-acetate-EDTA (TAE) dan Tris-borate-EDTA (TBE). Tingkat migrasi fragmen DNA pada kedua buffer tersebut berbeda karena adanya perbedaan kekuatan ion. Buffer akan menyediakan ion yang mendukung konduktivitas.

           



b.     Sodium Dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)

Pemisahan makromolekul dengan adanya arus listrik disebut dengan electrophoresis, biasanya digunakan untuk memisahkan proten dengan electrophoresis menggunakan gel polyacrylamide yang discontinuous yang bertindak sebagai media pendukung dan Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) untuk mendenaturasi protein. SDS merupakan deterjen anionik yang berarti ketika melarutkan molekul yang memiliki muatan negatif dalam kisaran pH yang lebar. Rantai polipeptida akan mengikat sejumlah SDS yang sebanding dengan massa relatif molekul. Muatan negatif pada SDS akan menghancurkan struktur komplek dari protein dan akan tertarik ke anoda.  Teknk ini didasarkan pada prinsip bahwa molekul yang mempunyai muatan akan bermigrasi menuju elektroda yang mempunyai muatan yang berlawanan.

Gel polyacrylamide dapat menahan molekul besar bermigrasi, sehingga kecepatan bermigrasinya tidak secepat molekul kecil. Hal ini dikarenakan adanya rasio antara muatan dengan massa yang hampir sama dengan SDS mendenaturasi polipeptida. Final separation dari protein hampir sepenuhnya bergantung pada perbedaan massa molekul relatif polipeptida. Pada gel kerapatan yang seragam, jarak migrasi relatif protein berbanding lurus dengan log massa.

Pemisahan protein menggunakan SDS-PAGE dapat digunakan untuk memperkirakan massa relatif suatu molekul dalam menentukan jumlah protein utama dan pendistribusian protein dalam fraksi. Metode pewarnaan yang berbeda dapat digunakan untuk mendeteksi protein yang rare agar dapat dipelajari sifat biokimia dari protein tersebut. Visualisasi protein dengan teknik pewarnaan (protein-specific), ukuran protein dapat dihitung dengan membandingkan jarak migrasi dengan marker yang diketahui.




Laboratorium Aktual di Indonesia


Referensi:

Bargen, C., Brockmeyer, J., dan Humpf, H. 2014. Meat authentication: A new HPLC-MS/MS based method for the fast and sensitive detection of horse and pork in highly processed food.  Institute of Food Chemistry, Westfälische Wilhelms-Universität Münster. Home page on-line. Available from:  http://pubs.acs.org/doi/suppl/10.1021/jf503468t/suppl_file/jf503468t_si_001.pdf. Diakses pada 10 Juni 2017.

Caprette, David R. 2012. Introduction to SDS-PAGE. Home page on-line. Available from: http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/sds-page/gellab2.html. Diakses pada 10 Juni 2017.

Lee P. Y., Costumbrado J., Hsu C. Y., dan Kim Y. H. 2012. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J. of Visualized Experiments (62). 


Popular posts from this blog

PENGAMATAN SEL TUMBUHAN & PLASMOLISIS

-
Image
PENGAMATAN SEL TUMBUHAN & PLASMOLISIS (Selasa, 7 Agustus 2012) A.   Tujuan Praktikum Pengamatan Sel Tumbuhan : Siswa dapat menunjukkan bagian-bagian sel berdasarkan hasil pengamatannya. Plasmolisis : Siswa dapat menjelaskan proses plasmolisis. B.    Alat dan bahan Pengamatan Sel Tumbuhan  Mikroskop Kaca Objek Kaca Penutup Pipet Pinset Kulit bawang merah Cutter Plasmolisis  Mikroskop Kaca Objek Kaca Penutup Daun Rhoeo discolor Larutan gula 10% Kertas isap Cutter C.   Cara kerja: Pengamatan Sel Tumbuhan : Sediakan kaca objek yang bersih, kemudian beri setetes air bersih dengan pipet. Dengan menggunakan jari atau cutter, kupaslah kulit bawang merah yang berwarna ungu hingga memperoleh kulit tipis (seperti kulit ari) yang disebut sebagai epidermis (pilih kulit bawang merah yang masih segar, bukan kulit yang kering). Letakkan epidermis tersebut dengan segera (jangan sampai kering) di atas se...
Read more

Sinopsis, Unsur Intrinsik, dan Unsur Ekstrinsik Novel Spring in London dan Hikayat Si Miskin

-
Image
Sinopsis Novel Spring in London karya Ilana Tan Danny Jo adalah model yang sedang belajar menjadi sutradara, dia memiliki Noona (kakak perempuan) bernama Anna Jo yang dulunya bekerja sebagai model juga namun kemudian terkenal sebagai perancang busana. Danny Jo adalah keturunan Korea dan bernama asli Jo In-Ho. Sebenarnya dia juga punya Hyung (kakak laki-laki) yang bernama Jo Seung Ho, tetapi sudah meninggal 2 tahun yang lalu karena kecelakaan akibat mabuk. Danny Jo yang bersahabat dengan Jung Tae Woo, seorang penyanyi, yang meminta Danny menjadi model music video- nya yang akan disyuting di London. Di London, Naomi Ishida, seorang model yang sangat sibuk, tinggal satu Flat bersama dengan Julie Humphrey, seorang anak orang kaya yang sedang terjun ke dalam dunia teater dan Christopher Scott, seorang koki yang gay . Naomi tipe orang yang tidak suka tempat yang sunyi, namun juga tak suka keramaian. Naomi membintangi music video seorang penyanyi Korea yang tak lain adalah Jung Tae...
Read more

Perjuangan Kemerdekaan Indonesia secara Fisik dan Diplomasi

-
1.     Keuntungan dan kerugian perjuangan mempertahankan kemerdekaan secara fisik & diplomasi ·          FISIK Lokasi Pertempuran Keuntungan Kerugian Surabaya   Surabaya hanya dapat dipertahankan selama 3 minggu , Pejuang Jawa Timur harus mundur ke luar kota dan bergerilya . Ambarawa Ambarawa berhasil dikuasai pasukan TKR.   Bandung   Bandung selatan dibumihanguskan dengan cara membakar beberapa tempat strategis . Medan   Medan dikuasai Sekutu karena markas TKR dan kantor gubernur dipindah ke Pematang Siantar . Palembang   Belanda menguasai Palembang, pasukan Indonesia harus mundur 20 km dari Palembang Bali   Seran...
Read more